Phos-tag™是一種可特異性捕獲磷酸化Ser、Thr、Tyr等物質(zhì)的功能分子，由日本廣島大學(xué)醫(yī)齒藥學(xué)綜合研究科醫(yī)學(xué)品分子機(jī)能科學(xué)研究室開發(fā)。以Phos-tag™ 丙烯酰胺（Phos-tag™ Acrylamide）為首開發(fā)的多種Phos-tag™ 產(chǎn)品被應(yīng)用于世界范圍內(nèi)的基礎(chǔ)研究，并且在GPCR通路及Wnt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析方面也取得了優(yōu)秀成果。

在制備SDS-PAGE預(yù)制膠過程中加入Phos-tag™ Acrylamide，即可根據(jù)磷酸化水平和磷酸化位點(diǎn)分離磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白。

原理：

1. 電泳中的磷酸化蛋白捕獲2個(gè)二價(jià)金屬離子。

2. 磷酸化水平越高電泳速度越慢。

3. 根據(jù)磷酸化水平進(jìn)行分離。（即使磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目相同，但只要位置不同就能分離）

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

①α-casein去磷酸化反應(yīng)隨時(shí)間的變化

使用堿性磷酸酶隨時(shí)間（孵育時(shí)間：0-120 min）處理α-casein，并使用Phos-tag™ SDS-PAGE和常規(guī)SDS-PAGE分離去磷酸化處理的樣品。

②野生型/突變型Noxa表達(dá)的MCL-1磷酸化水平變化

③二維電泳中的應(yīng)用：hnRNP K異構(gòu)體的磷酸化分析

通過免疫沉淀法，從經(jīng)LPS刺激后的小鼠巨噬細(xì)胞J774.1的細(xì)胞核提取液中，分離得到hnRNP K。在二維電泳中，一維使用IPG膠（pH 4.7-5.9），二維使用Phos-tag™ SDS-PAGE，分離hnRNP K的異構(gòu)體（66 kDa，64 kDa）。使用質(zhì)譜儀可以確認(rèn)不同的點(diǎn)代表不同的異構(gòu)體或修飾位點(diǎn)。

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